Surface Plasmon Resonance
Comment ça marche
Une puce de capteur SPR porte un fin film d’or ; une lumière polarisée projetée depuis l’arrière selon un angle précis y excite un plasmon de surface dont l’angle de résonance est extrêmement sensible à l’indice de réfraction dans les 100 à 300 nm proches de la surface. Un des partenaires de liaison (le ligand) est immobilisé sur la puce — le plus souvent par couplage aminé à une matrice de dextrane carboxyméthylé sur une puce CM5, ou via un anticorps de capture, un système streptavidine-biotine ou étiquette His/NTA lorsqu’une fixation plus définie ou réversible est préférable — tandis que le second partenaire (l’analyte) circule à sa surface dans un canal microfluidique. À mesure que l’analyte se lie, l’indice de réfraction local augmente et l’angle de résonance se déplace, ce qui est tracé en continu comme une réponse (en unités de résonance, RU) en fonction du temps — un sensorgramme dont la phase montante pendant l’injection est l’association, et la phase descendante après l’injection la dissociation.
Ce que l’on mesure
Le sensorgramme étant enregistré en continu pendant les deux phases, son ajustement à un modèle de liaison (le plus souvent 1:1 de type Langmuir, bien que des modèles plus complexes existent pour l’avidité ou les changements conformationnels) résout séparément la constante de vitesse d’association kon et la constante de vitesse de dissociation koff, et non seulement leur rapport. La constante de dissociation à l’équilibre KD = koff/kon s’en déduit, mais deux interactions de même KD peuvent se comporter très différemment en pratique — une paire kon lent/koff lent reste liée bien plus longtemps une fois formée qu’une paire rapide/rapide de même affinité globale, ce qui compte pour l’intervalle de dosage d’un anticorps thérapeutique autant que pour son affinité nominale. La réponse maximale (Rmax) confirme également que la surface immobilisée se comporte comme attendu et fournit un contrôle de la concentration active.
Le déroulement d’une expérience
Une expérience commence par le choix de la puce et l’immobilisation : la densité de ligand est maintenue aussi faible que possible, une densité élevée augmentant le risque de limitation par transport de masse, où la diffusion de l’analyte vers la surface — plutôt que la réaction de liaison elle-même — devient l’étape limitante et déforme la cinétique mesurée. L’analyte est ensuite injecté selon une série de dilutions sur plusieurs concentrations, chacune suivie d’une phase de dissociation puis d’une étape de régénération qui élimine l’analyte lié sans endommager le ligand immobilisé, permettant de réutiliser la même surface pour la concentration suivante. Une expérience cinétique complète — plusieurs concentrations, chacune avec association, dissociation et régénération — dure généralement quelques heures et ne consomme que des microgrammes de matériel, le volume de la cellule de flux étant minime.
Applications
Ingénierie d’anticorps et maturation d’affinité. La cinétique SPR guide les campagnes de maturation d’affinité en montrant si une mutation améliore l’affinité par une association plus rapide, une dissociation plus lente, ou les deux — une information qu’une mesure d’affinité ponctuelle ne peut fournir.
Cartographie d’épitopes. Des expériences de liaison par paires — capturer un antigène avec un anticorps et tester si un second anticorps peut encore se lier — construisent une matrice de compétition regroupant les anticorps par groupe d’épitopes, sans marquage ni donnée structurale.
Engagement de cible en découverte de médicaments. La SPR confirme et quantifie l’engagement d’une petite molécule ou d’un produit biologique sur sa cible prévue, et est utilisée aux côtés d’essais cellulaires pour relier l’affinité biochimique à l’activité fonctionnelle.
Caractérisation d’anticorps thérapeutiques. Le criblage cinétique d’anticorps monoclonaux candidats — par exemple contre des cibles inflammatoires comme le TNF-α dans les programmes sur la polyarthrite rhumatoïde ou la maladie de Crohn — est une étape standard avant qu’un candidat ne poursuive son développement.
Forces et limites
La fenêtre cinétique de la SPR va d’environ kon jusqu’à 106–107 M-1s-1 et de KD jusqu’au picomolaire bas dans de bonnes conditions, mais des vitesses d’association très rapides se heurtent à la même limitation par transport de masse qu’une faible densité de ligand vise à éviter, et des vitesses de dissociation très lentes (complexes très stables et durables) peuvent être difficiles à distinguer d’une ligne de base plate et non dissociante dans un temps d’essai raisonnable. L’un des partenaires devant être immobilisé, les résultats peuvent en principe différer d’une mesure en solution libre (par exemple l’ITC) si l’immobilisation perturbe le site de liaison — un risque minimisé en maintenant une faible densité de ligand et, si possible, en immobilisant le partenaire le plus petit ou le moins sensible fonctionnellement. En contrepartie, la SPR nécessite bien moins de matériel que l’ITC, fonctionne sur une très large gamme d’affinités, et — seule parmi les techniques de liaison de la plateforme — sépare les constantes d’association et de dissociation plutôt que de ne rapporter que l’affinité.
Questions fréquentes
Quelle quantité de matériel dois-je envoyer ?
Deux quantités très différentes, car les deux partenaires n'ont pas le même rôle.
Le partenaire immobilisé, le ligand, est peu consommé : 20 à 100 µg à 10-50 µg/ml en tampon de couplage suffisent pour l'immobilisation et le pH scouting qui la précède. Encore moins pour une surface de capture.
Le partenaire injecté, l'analyte, est le poste coûteux. Il faut une gamme de cinq à huit concentrations couvrant environ 0,1 à 10 fois le KD, chaque injection consommant 50 à 150 µl selon le débit et le temps de contact. Une cinétique en duplicat avec une concentration maximale de 100 nM et un analyte de 50 kDa consomme de l'ordre de 100 µg. Si le KD est micromolaire, le besoin grimpe vite — c'est le calcul à faire avant de commander une synthèse peptidique.
Lequel de mes deux partenaires doit-on greffer sur la puce ?
Le signal est proportionnel à la masse qui arrive sur la surface : le signal maximal vaut Rmax = (MM analyte / MM ligand) × niveau d'immobilisation × stœchiométrie. Immobiliser le petit partenaire et injecter le grand donne un signal fort ; l'inverse donne un signal faible. Un composé de 300 Da injecté sur une protéine de 50 kDa immobilisée à 5000 RU donne un Rmax d'environ 30 RU : exploitable, mais sans marge pour une ligne de base qui dérive.
Le second critère est la robustesse. Le partenaire immobilisé subit des dizaines de cycles d'injection et de régénération : ce doit être celui qui les supporte. Anticorps, protéines étiquetées et oligonucléotides biotinylés sont en général les meilleurs candidats pour la surface.
Quand c'est possible, nous testons les deux orientations pendant la mise au point ; un écart entre elles est une information, pas une gêne.
Ma protéine doit-elle être modifiée ?
Cela dépend de la stratégie de couplage, et il y en a plusieurs.
Le couplage aminé fixe la protéine par ses lysines sur le dextran carboxyméthylé d'une puce CM5. Aucune modification n'est nécessaire, mais la fixation est aléatoire et peut masquer le site de liaison ou abîmer l'activité. C'est l'option par défaut, et elle convient à la plupart des protéines.
La capture évite ce problème. Étiquette His sur surface NTA ou anti-His, biotine sur streptavidine, Fc sur protéine A ou anti-Fc, GST sur anti-GST : la protéine est retenue dans une orientation définie et la surface est reconstruite à chaque cycle. Cela suppose une étiquette, mais donne en général une cinétique plus propre.
Donc : aucune modification n'est strictement obligatoire, mais une étiquette déjà présente améliore souvent l'expérience. Indiquez-nous les étiquettes de la construction avant la conception du dosage.
Mon composé est dissous dans du DMSO. Est-ce un problème ?
Le DMSO est gérable jusqu'à environ 5% et courant à 1-2%, mais il impose de la rigueur. Son indice de réfraction est très supérieur à celui du tampon : un écart de 0,1% entre l'échantillon et le tampon de course produit un saut plus grand que la liaison d'une petite molécule.
Deux règles en découlent. Le tampon de course doit contenir exactement le même pourcentage de DMSO que tous les échantillons, ce qui suppose de diluer le composé dans du tampon déjà additionné de DMSO, et non dans du tampon seul. Et une série de correction de solvant — typiquement huit étalons encadrant le pourcentage nominal — est injectée à chaque série pour soustraire la contribution résiduelle de volume.
Le même raisonnement vaut pour tout additif : glycérol, sel élevé, détergent au-delà de ce que contient le tampon de course. Ce qui est dans l'échantillon doit être dans le tampon.
Quelles affinités et quelles constantes de vitesse peut-on réellement mesurer ?
Des constantes d'association d'environ 10^3 à 10^7 M-1s-1 et de dissociation d'environ 10^-5 à 0,5 s-1 sont accessibles sur un T200, ce qui place le KD du picomolaire au micromolaire élevé.
Les limites sont pratiques plus que théoriques. Une kd supérieure à 0,1 s-1 signifie que le complexe se dissocie pendant la phase de dissociation elle-même : seule une affinité à l'équilibre est extractible, pas les constantes de vitesse séparées. Une kd inférieure à 10^-5 s-1 signifie que rien de mesurable ne se décroche pendant la course : la vitesse de dissociation devient une borne inférieure et la régénération devient le point dur. Les vitesses d'association très rapides se heurtent à la limitation par transport de masse, où la vitesse mesurée reflète la diffusion vers la surface et non la liaison ; une faible densité de ligand et un débit élevé repoussent ce seuil, et l'ajustement inclut un terme de transport de masse quand on ne peut pas l'éviter.
Que contient le rapport ?
Les sensorgrammes référencés — surface échantillon moins surface de référence moins injections à blanc —, les valeurs ajustées de ka, kd et KD avec leurs erreurs types, le Rmax, les résidus d'ajustement et le chi², et le cas échéant l'affinité à l'équilibre comme estimation indépendante.
Deux valeurs méritent votre propre regard. Le Rmax ajusté doit être proche du Rmax prédit à partir du niveau d'immobilisation et des masses moléculaires ; un Rmax ajusté très inférieur indique qu'une grande part du ligand immobilisé est inactive. Et le chi² doit être faible devant l'amplitude du signal — une courbe d'allure impeccable avec un résidu systématique signale qu'un modèle 1:1 est imposé à quelque chose de plus complexe, avidité d'un analyte bivalent ou surface hétérogène.
Mon analyte s'adsorbe partout. Peut-on y remédier ?
Souvent, et cela relève de la mise au point normale plutôt que de l'échec.
Les premiers outils sont les références : une cellule de référence activée puis bloquée, des injections de tampon seul soustraites à chaque cycle, et une surface témoin portant une protéine non pertinente de nature comparable. Une liaison non spécifique qui survit à ces trois corrections relève de la chimie de surface, et les leviers sont la force ionique (150 mM puis 300-500 mM NaCl), un tensioactif non ionique à 0,05%, des protéines porteuses comme la BSA, du dextran carboxyméthylé soluble pour concurrencer la matrice, et le pH. Les protéines très basiques se lient électrostatiquement au dextran chargé négativement ; une puce peu chargée comme la C1 ou une surface de capture contourne le problème au lieu de le combattre.
La régénération est l'autre moitié du travail. La condition doit décrocher l'analyte sans inactiver le ligand, et sa recherche passe par un criblage de solutions acides, basiques et salines. Si rien ne convient, le format cinétique à cycle unique supprime la régénération.
Peut-on travailler avec des protéines membranaires, de l'ADN, des cellules entières ou du sérum ?
L'ADN et l'ARN biotinylés sur puce streptavidine comptent parmi les systèmes SPR les plus propres, et l'étude de petites molécules sur surface protéique est courante.
Les protéines membranaires se traitent soit solubilisées en détergent sur une puce classique, le détergent étant présent au-dessus de sa CMC dans le tampon de course, soit sous forme de liposomes ou de nanodisques capturés sur puce L1. Les deux demandent du temps de mise au point.
Les surnageants bruts et le sérum peuvent être injectés sur une surface de capture, à condition que la capture soit spécifique et que l'on accepte une correction de volume plus lourde ; l'appareil le supporte mieux qu'on ne le croit. Les cellules entières sortent du cadre : le champ évanescent ne s'étend qu'à quelques centaines de nanomètres de l'or, une cellule est bien plus grande.
Combien de temps prend un projet SPR ?
Le temps machine est court ; c'est la mise au point qui occupe le calendrier.
L'immobilisation avec son pH scouting prend une demi-journée. Une titration cinétique complète, cinq à huit concentrations en duplicat avec régénération entre les cycles, dure trois à six heures et peut tourner la nuit sans surveillance. Une fois la méthode établie, un échantillon supplémentaire se mesure dans la journée.
L'imprévisible, c'est d'arriver à une surface fonctionnelle : pH scouting, choix de la chimie de couplage, criblage de régénération, vérification que la surface reste active après dix cycles. Pour un couple protéine-anticorps sans histoire, un à deux jours ; pour une protéine membranaire fragile avec un analyte collant, cela peut prendre deux semaines. C'est précisément pourquoi le devis sépare en général une phase de mise au point et une phase de mesure.
De quoi avez-vous besoin de ma part avant de commencer ?
À ce stade, une description du système vaut plus que les échantillons : qui se lie à qui, l'affinité attendue même à l'ordre de grandeur, les masses moléculaires, les étiquettes, le point isoélectrique de la protéine à immobiliser, et les limites de stabilité connues.
Le pI importe parce que le couplage aminé repose sur une préconcentration électrostatique dans le dextran, qui exige un tampon de couplage à pH inférieur au pI et à faible force ionique. Une protéine de pI 4,5 ne se préconcentre pas de cette façon et demande une autre voie.
Avec les échantillons : les deux partenaires, la composition souhaitée du tampon de course, et toute exigence particulière — cation divalent, réducteur. Si l'analyte est en DMSO, envoyez le stock séparément plutôt que prédilué.
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Instruments
Biacore T200