Isothermal Titration Calorimetry

Comment ça marche

Une expérience d’ITC titre un partenaire de liaison (le ligand, dans la seringue) dans l’autre (la macromolécule, dans la cellule) par une série de petites injections, à température constante. La chambre réactionnelle étant thermiquement isolée, l’appareil mesure la puissance différentielle nécessaire pour maintenir la cellule et une cellule de référence à la même température à mesure que la chaleur est libérée ou absorbée par la liaison — ce signal brut est intégré, injection après injection, en une courbe de titration donnant la chaleur par mole d’injectant en fonction du rapport molaire ligand/macromolécule. L’ajustement d’un modèle de liaison — le plus souvent un modèle 1:1, mais des modèles multi-sites ou séquentiels selon les cas — à cette courbe donne, en une seule expérience, la constante de dissociation (KD), la stœchiométrie de la réaction (n) et l’enthalpie de liaison (ΔH) ; l’énergie libre de liaison (ΔG = −RT ln Ka) et l’entropie (ΔS = (ΔH − ΔG)/T) s’en déduisent directement. Aucun marquage fluorescent, radioactif ou chimique n’est nécessaire, car la chaleur de liaison est elle-même le signal — ce qui implique en revanche que le tampon doit être identique pour les deux partenaires, un tampon mal apparié produisant des chaleurs de dilution qui masquent le signal de liaison.

Ce que l’on mesure

Une seule expérience d’ITC donne le profil thermodynamique complet d’une interaction, et non la seule affinité. La constante de dissociation KD fixe l’échelle de concentration de l’interaction ; la stœchiométrie n confirme le nombre de molécules de ligand liées par macromolécule (et révèle une liaison multivalente ou inattendue) ; l’enthalpie ΔH et l’entropie ΔS révèlent la force physique à l’origine de l’affinité — une ΔH favorable importante traduit typiquement des liaisons hydrogène et des contacts de van der Waals formés lors de la liaison, tandis qu’une ΔS favorable pointe plutôt vers l’effet hydrophobe ou la libération d’eau ordonnée de l’interface de liaison. Deux ligands de KD identique peuvent présenter des équilibres ΔH/ΔS très différents, une information invisible aux essais d’affinité seule mais qui oriente le choix de la série chimique à optimiser.

Le déroulement d’une expérience

La macromolécule et le ligand sont préparés dans le même tampon, filtrés et dégazés. Le titrant (seringue) est en général formulé à une concentration environ dix fois supérieure à celle du titré (cellule) ; pour une interaction d’affinité inconnue, des points de départ d’environ 10 µM de macromolécule en cellule et 120 µM de ligand en seringue constituent une base raisonnable. L’appareil réalise ensuite une série programmée d’injections — le plus souvent 15 à 25 — de façon automatique, l’expérience entière durant nettement moins d’une heure, plusieurs expériences pouvant être enchaînées sans surveillance pendant la nuit. Le paramètre de conception le plus important est la valeur c de Wiseman (c = Ka × [macromolécule]), qui doit se situer environ entre 10 et 100 : trop faible, la courbe de titration est trop plate pour ajuster KD de façon fiable ; trop élevée, la courbe devient une fonction en escalier dont on ne peut plus extraire KD, même si la stœchiométrie reste accessible.

Applications

Découverte de médicaments et criblage par fragments. L’ITC classe les ligands candidats par affinité et, de façon plus informative, par mécanisme de liaison lors de la validation des hits, du criblage par fragments et de l’optimisation de composés-tête — distinguant les liants pilotés par l’enthalpie, qui tendent à former des contacts spécifiques et optimisables, de ceux pilotés par l’entropie.

Conception basée sur la structure. Titrer un composé en présence d’un second ligand révèle une liaison compétitive, coopérative ou indépendante, aidant à identifier les contacts intermoléculaires que doit cibler ensuite une campagne de conception basée sur la structure.

Complexes protéine–protéine et de signalisation. L’ITC quantifie l’affinité et la stœchiométrie de complexes impliqués dans la signalisation cellulaire et la biologie des maladies, y compris les interactions entre protéines associées à des pathologies et les petites molécules ou peptides étudiés en oncologie et en recherche sur la neurodégénérescence.

Produits naturels et nanovecteurs. Au-delà des ligands classiques de petite taille, l’ITC est de plus en plus utilisée pour caractériser la liaison à des nanovecteurs biomimétiques — liposomes, nanoparticules lipidiques solides, vésicules extracellulaires — pertinents pour la délivrance de médicaments.

Forces et limites

La fenêtre pratique de l’ITC se situe environ entre 10 nM et 100 µM de constante de dissociation : les interactions plus fortes nécessitent des concentrations de macromolécule si faibles que le signal de chaleur disparaît dans le bruit, tandis que les interactions plus faibles exigent des concentrations si élevées que l’agrégation ou la liaison non spécifique peuvent déformer la courbe de titration. La pureté de l’échantillon et la détermination précise de sa concentration comptent ici plus que dans la plupart des techniques biophysiques, une erreur de 10 à 20 % sur la concentration du titrant se répercutant directement sur les valeurs ajustées de KD, ΔH et n. Comparée à la SPR, l’ITC nécessite davantage de matériel et ne résout pas les constantes de vitesse d’association et de dissociation — mais, contrairement à la SPR, elle ne nécessite l’immobilisation ni le marquage d’aucun des deux partenaires, mesure l’interaction librement en solution, et reste la seule technique courante donnant directement enthalpie et entropie plutôt qu’une dérivée dépendant de la température.

Questions fréquentes

Quelle quantité de protéine faut-il ?

Sur le PEAQ-ITC, la cellule fait 200 µl et on en charge environ 280 µl ; la seringue fait 40 µl et on en charge 75 µl. On travaille en général à 10-50 µM en cellule et 10 à 20 fois plus en seringue. Pour une protéine de 25 kDa à 20 µM, cela représente environ 150 µg par titration. Prévoyez trois titrations — un essai, la mesure, les contrôles — soit 0,5 à 1 mg confortablement.

Le VP-ITC a une cellule de 1,4 ml et demande presque dix fois plus. On ne le sort que si la chaleur par injection est trop faible pour les appareils 200 µl.

La concentration dépend de l'affinité et non d'une règle fixe : la concentration en cellule doit valoir 10 à 100 fois le Kd. Sans estimation du Kd, envoyez de quoi faire une titration exploratoire, on ajuste ensuite.

Dans quel tampon mes échantillons doivent-ils être ?

Les deux partenaires doivent être dans le même tampon, et « le même » signifie le même lot de liquide, pas la même recette recopiée. Dialysez la protéine une nuit et utilisez le dialysat final pour dissoudre ou diluer le ligand. Une différence de 1 mM en sel ou de 0,05 unité de pH génère des chaleurs de dilution qui peuvent dépasser le signal de liaison.

Si le ΔH vous intéresse, évitez les tampons à forte enthalpie d'ionisation. Le Tris est à environ 47 kJ/mol, l'HEPES à 20, le phosphate à 5. Si la liaison capte ou libère un proton, l'enthalpie du tampon s'ajoute à la valeur mesurée. Refaire la titration dans deux tampons de ΔHion différents permet justement de le détecter.

Le DTT s'oxyde et fait dériver la ligne de base ; 0,2-0,5 mM de TCEP se comporte bien mieux. Glycérol sous 5% et rigoureusement identique des deux côtés.

Qu'obtient-on à l'issue d'une mesure ITC, et avec quelle précision ?

Une titration donne directement le Kd, l'enthalpie de liaison ΔH et la stœchiométrie n à partir de la chaleur ; ΔG et ΔS s'en déduisent. Aucun modèle de la molécule n'intervient dans la mesure.

Le ΔH est reproductible à 5-10% près quand les concentrations sont connues. Le Kd s'accorde en général à un facteur deux près entre deux préparations indépendantes. Le point faible reste la concentration : une erreur sur la concentration en protéine active se retrouve dans n, une erreur sur le ligand se retrouve dans le ΔH. Précisez comment chaque concentration a été déterminée — A280 avec coefficient d'extinction calculé, analyse d'acides aminés, pesée — car c'est cela qui fixe la barre d'erreur réelle.

Y a-t-il une gamme d'affinité où l'ITC ne fonctionne plus ?

La fenêtre est fixée par la valeur c, c = n·[M]/Kd, où [M] est la concentration en cellule. Entre environ 5 et 500, l'isotherme est sigmoïde avec un point d'inflexion net et les trois paramètres sortent. Entre 1 et 5, la courbe est plate : le Kd reste ajustable si l'on fixe n et si les concentrations sont fiables. Au-delà de 1000, l'isotherme devient une marche — on obtient n et ΔH, et seulement une borne inférieure d'affinité.

En pratique, un Kd de 10 nM à 100 µM se mesure directement. Les affinités plus fortes passent par la titration par déplacement : on sature la protéine avec un compétiteur plus faible de Kd connu, puis on titre le ligand fort dans ce mélange. Un Kd au-delà de 1 mM exigerait des concentrations que la plupart des protéines ne supportent pas.

Faut-il marquer ou immobiliser ma protéine ?

Rien n'est fixé ni greffé. La mesure se fait en solution libre ; la seule exigence est que les deux partenaires restent solubles et repliés à la concentration de travail pendant les quatre-vingt-dix minutes de la titration.

C'est en général la raison pour laquelle on vient à l'ITC après un résultat de fluorescence ou de SPR : pas de surface, pas d'étiquette, pas de fluorophore susceptible de déplacer la valeur.

Peut-on travailler sur des protéines membranaires, des acides nucléiques ou des échantillons bruts ?

Les acides nucléiques et les petites molécules sont courants, de même que les systèmes protéine-protéine et protéine-peptide dès lors que les concentrations sont atteignables.

Les protéines membranaires en détergent sont possibles si le détergent est au-dessus de sa CMC et exactement à la même concentration en cellule et en seringue. Les chaleurs de dilution des micelles sont importantes et masquent un signal de liaison modeste. Les nanodisques et les SMALP ont été mesurés, avec la même contrainte d'appariement du bruit de fond des particules vides.

Les lysats, le sérum et les milieux conditionnés ne conviennent pas. Tout ce qui change d'état au mélange produit de la chaleur : l'échantillon doit être un système à deux composants défini.

Ma titration est plate. Qu'est-ce qui a échoué ?

Une trace plate a peu de causes possibles. La protéine peut déjà être saturée par un ligand entraîné depuis la purification. L'interaction peut être réelle mais quasi athermique à cette température, avec un ΔH proche de zéro ; refaire la mesure à 15 °C et à 35 °C tranche en général, puisque le ΔCp déplace le ΔH avec la température. La fraction active peut être très inférieure à la concentration nominale. Ou il n'y a effectivement pas de liaison.

Une trace où la chaleur reste constante et non nulle de la première à la dernière injection traduit le plus souvent un décalage de tampon, pas une interaction faible. Nous faisons systématiquement les contrôles ligand-dans-tampon et tampon-dans-protéine pour distinguer les deux.

Combien de temps dure une expérience ?

Une titration de 13 à 19 injections sur le PEAQ-ITC prend 60 à 90 minutes, auxquelles s'ajoutent l'équilibration et les lavages entre séries. Le VP-ITC tourne plutôt autour de 2,5 heures. Une journée permet six à huit titrations, contrôles compris.

Ce qui allonge un projet, c'est le nombre de conditions et non le temps machine : une série en température, une série en pH, une expérience de compétition ou un panel de mutants multiplient chacun le nombre de mesures. La date de rendu dépend de la file d'attente et du nombre de conditions retenues dans le devis.

Que faut-il envoyer avec les échantillons ?

La protéine dialysée, le ligand, et au moins 15 à 20 ml du tampon de dialyse final dans un tube séparé. Ce tampon n'est pas un supplément : c'est avec lui que se font les blancs et toutes les dilutions.

Côté documentation, il nous faut : composition du tampon avec pH et réducteur, concentration de chaque échantillon et méthode de dosage, masses moléculaires, coefficients d'extinction, limite de solubilité du ligand, et une valeur attendue de Kd si vous en avez une, même à l'ordre de grandeur près. Si le ligand est en DMSO, indiquez la concentration du stock et le pourcentage final.

Précisez le mode de conservation de la protéine et sa tolérance aux cycles de congélation, et expédiez en conséquence sur carboglace ou sur glace.

Dois-je être présent, et puis-je apprendre à utiliser l'appareil moi-même ?

La présence n'est pas nécessaire. La plupart des commandes se déroulent en prestation : les échantillons arrivent, nous mesurons, vous recevez les thermogrammes bruts, les paramètres ajustés et un rapport court.

Venir pour la première titration a du sens si le système est atypique ou si vous prévoyez de faire beaucoup d'ITC ensuite. Une formation pratique est possible pour les personnes qui utiliseront l'appareil régulièrement ; comptez deux à trois séances encadrées avant de travailler seul. Pour une mesure isolée, cela vaut rarement le déplacement.

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Instruments

ITC200 ITC200 PEAQ-ITC PEAQ-ITC VP-ITC VP-ITC