Dynamic Light Scattering
Comment ça marche
Les particules en suspension en solution se déplacent constamment et aléatoirement sous l’effet du mouvement brownien, les particules plus petites diffusant plus vite que les plus grandes. La DLS illumine l’échantillon avec un laser et enregistre la lumière diffusée à un angle fixe au cours du temps ; les particules étant en mouvement constant, l’intensité de la lumière diffusée fluctue, et l’appareil calcule une fonction d’autocorrélation de ces fluctuations. Des fluctuations rapides font décroître rapidement la fonction de corrélation et correspondent à des particules petites, diffusant vite ; des fluctuations lentes la font décroître lentement et correspondent à des particules plus grandes et plus lentes. L’ajustement de cette décroissance à la relation de Stokes-Einstein convertit le coefficient de diffusion mesuré en un rayon hydrodynamique — le rayon d’une sphère équivalente ayant le même comportement de diffusion — pour chaque population de particules présente.
Ce que l’on mesure
Le résultat principal est une distribution de taille (pondérée par intensité par défaut, l’intensité diffusée variant comme la puissance sixième du diamètre des particules) exprimée sous forme d’une taille hydrodynamique moyenne Z et d’un indice de polydispersité (PDI) : un PDI inférieur à environ 0,1 indique un échantillon fortement monodisperse, inférieur à environ 0,25 est généralement considéré comme acceptablement monodisperse pour la plupart des applications protéiques, et des valeurs plus élevées signalent une distribution large ou multimodale. La distribution en intensité étant si fortement pondérée vers les grandes particules, même une population très réduite d’agrégats — invisible en mesure de concentration ou d’absorbance — peut apparaître comme un pic distinct et bien séparé, ce qui fait précisément de la DLS un premier crible si sensible à l’agrégation.
Le déroulement d’une expérience
Les échantillons sont filtrés (généralement à travers une membrane de 0,2 à 0,45 µm) immédiatement avant la mesure pour éliminer poussières et gros débris qui domineraient sinon le signal pondéré en intensité et fausseraient le résultat, puis équilibrés à la température de mesure — un équilibrage thermique insuffisant est l’une des causes les plus courantes de mauvaise reproductibilité. La mesure elle-même dure de l’ordre d’une à deux minutes par échantillon et ne nécessite qu’un petit volume, ce qui explique que la DLS soit utilisée comme contrôle rapide et non destructif tout au long d’un flux de travail — criblage de conditions de tampon, suivi d’une purification, ou surveillance d’une formulation au cours d’une étude de stabilité — plutôt que réservée à une mesure ponctuelle finale.
Applications
Criblage d’agrégation et contrôle qualité. La DLS est le contrôle de routine de première intention pour l’agrégation des protéines et anticorps tout au long du développement et de la fabrication, signalant les échantillons nécessitant un suivi plus lent et plus résolutif comme l’AUC.
Développement de formulation. Comparer taille et PDI entre tampons candidats, valeurs de pH et excipients au cours des études de préformulation et de stabilité identifie les conditions maintenant un produit biologique monodisperse dans le temps.
Repliement et suivi de procédé. La DLS suit la solubilisation des corps d’inclusion et le repliement des protéines recombinantes lors du traitement en aval, et sert de contrôle en cours de procédé pendant la fabrication de vaccins et de produits biologiques.
Dimensionnement de nanoparticules et vecteurs viraux. Au-delà des protéines, la DLS dimensionne les nanoparticules vectrices de médicaments et peut signaler des agrégats dans les préparations de vecteurs viraux comme les AAV, aux côtés de méthodes de comptage de particules pour un dimensionnement de confirmation.
Forces et limites
La DLS ne peut résoudre deux populations différant de moins d’un facteur d’environ trois à cinq en taille, si bien que des espèces de tailles proches (par exemple un monomère et un variant conformationnel de taille similaire) peuvent apparaître comme un pic élargi unique plutôt que deux pics distincts ; et à concentration d’échantillon plus élevée, la diffusion multiple — la lumière diffusée plus d’une fois avant d’atteindre le détecteur — biaise la taille apparente et augmente la polydispersité apparente, un effet distinct d’une réelle agrégation qu’il faut savoir reconnaître plutôt que confondre avec elle. La DLS ne peut pas non plus identifier chimiquement une espèce détectée, seulement sa taille apparente — c’est pourquoi un signal DLS est généralement suivi d’une technique résolvant l’identité ou le comptage, comme l’AUC ou la SEC. Sa force est à l’opposé de ce compromis : une préparation d’échantillon minimale, une mesure en quelques minutes, et une sensibilité suffisante pour détecter le premier signe de problème avant qu’il n’apparaisse ailleurs.
Questions fréquentes
Quelle quantité d'échantillon faut-il, et à quelle concentration ?
Très peu. La cuve quartz faible volume accepte 12 µl, les petites cuves jetables 45 µl, et une mesure standard en cuve classique environ 70 µl. L'échantillon est restitué : rien n'est consommé.
La concentration varie en sens inverse de la taille, la diffusion augmentant fortement avec le volume des particules. Une estimation de travail pour les protéines est 1,44/MM(kDa) mg/ml comme limite basse : environ 0,6 mg/ml pour une protéine de 10 kDa, environ 0,06 mg/ml pour une de 100 kDa. La plupart des mesures se font entre 0,5 et 2 mg/ml, et la qualité s'améliore avec la concentration jusqu'au point où les particules commencent à interagir et où la taille apparente diminue. Pour un échantillon nouveau, une série à deux ou trois concentrations est le moyen sûr de vérifier qu'on n'est pas dans ce régime.
Comment préparer l'échantillon ?
Filtrez-le ou centrifugez-le, puis traitez-le comme un échantillon d'optique et non comme un échantillon de biochimie.
La poussière est l'ennemi principal. Une seule particule de 1 µm traversant le faisceau diffuse autant qu'un million de protéines de 10 nm, et produit les pics et les dérives qui ruinent un corrélogramme. Filtrez le tampon à 0,02-0,1 µm, filtrez ou centrifugez l'échantillon — 10 minutes à 15 000 g suffisent souvent, et ménagent davantage un complexe fragile qu'un passage forcé sur membrane — et pipetez lentement pour éviter les bulles.
Les cuves doivent être propres et manipulées par leurs faces dépolies. Un reste de détergent de lavage apparaît en pic vers 5-10 nm et ressemble à s'y méprendre à une protéine.
Que disent réellement les résultats ?
La grandeur mesurée est la fonction d'autocorrélation d'intensité. Un ajustement par cumulants en tire le diamètre hydrodynamique moyen en z et l'indice de polydispersité PdI ; une analyse de distribution donne des pics en intensité, convertibles en distributions en volume et en nombre à l'aide de l'indice de réfraction du matériau.
Pour les protéines, les repères usuels sont : PdI inférieur à 0,1, échantillon monodisperse ; 0,1-0,4, modérément polydisperse et généralement encore interprétable ; au-delà de 0,4, l'analyse de distribution n'a plus de sens et seule la présence de matériel de grande taille peut être signalée. Le critère correspondant en analyse protéine est une polydispersité inférieure à 20%.
Le diamètre hydrodynamique est celui d'une sphère ayant le même coefficient de diffusion que votre particule, couche d'hydratation comprise. Pour une protéine allongée ou flexible, il dépasse systématiquement les dimensions cristallographiques : c'est une propriété de la grandeur, pas un artefact.
La DLS peut-elle donner la masse moléculaire et l'état d'oligomérisation ?
Pas correctement, et c'est le malentendu le plus fréquent au sujet de la technique.
La DLS mesure un coefficient de diffusion. Le convertir en masse suppose une hypothèse de forme, et la conversion standard suppose une particule globulaire compacte. Pour une protéine globulaire ordinaire, l'estimation tombe à un facteur deux près ; pour tout ce qui est allongé, désordonné, glycosylé ou multidomaine, l'écart peut atteindre un facteur bien supérieur. Distinguer un monomère d'un dimère exigerait une résolution que la méthode n'a pas : deux espèces doivent différer d'un facteur 3 à 5 en diamètre pour apparaître comme deux pics distincts.
Si la question porte sur l'état d'oligomérisation, la SEC-MALS ou l'AUC y répondent. La DLS est l'outil adapté à une autre question : cet échantillon est-il agrégé, et à quel point.
Pourquoi un échantillon propre en SDS-PAGE donne-t-il un mauvais résultat en DLS ?
Parce que les deux techniques pondèrent l'échantillon de façon radicalement différente. L'intensité diffusée varie approximativement comme la puissance sixième du diamètre : un agrégat de 100 nm diffuse environ un million de fois plus qu'un monomère de 10 nm. Une contamination de 0,01% en masse sous forme de gros agrégats peut dominer la distribution en intensité et masquer complètement le monomère.
Cette sensibilité est l'objet même de la mesure et non un défaut. La DLS est le moyen le moins coûteux de découvrir, avant d'engager de la protéine dans un criblage de cristallisation, une grille de cryo-EM ou une puce SPR, qu'une fraction de la préparation est agrégée. Un gel ne le voit pas, et une colonne SEC peut le retenir sur le fritté.
D'où la lecture : la distribution en intensité indique ce qui est présent, la distribution en volume indique en quelle quantité, et les deux diffèrent souvent beaucoup pour un échantillon contenant une petite population d'agrégats.
Que devez-vous savoir sur mon tampon ?
La viscosité et l'indice de réfraction du solvant, car le coefficient de diffusion est converti en taille par la relation de Stokes-Einstein, où les deux interviennent directement. Pour des tampons aqueux classiques en dessous de 200 mM, les valeurs de l'eau suffisent.
Au-delà, non. Dix pour cent de glycérol augmentent la viscosité d'environ 30%, et une taille calculée avec la valeur de l'eau serait surestimée d'autant. Saccharose, sel élevé, urée et guanidinium exigent chacun leurs propres valeurs : envoyez la composition exacte, nous utilisons des viscosités tabulées ou mesurées.
Les détergents méritent une mention à part : au-dessus de la CMC, la population de micelles apparaît, généralement entre 3 et 10 nm, à côté de votre protéine. C'est une mesure fidèle du contenu du tube, mais elle peut être prise pour une espèce protéique si personne ne signale la présence du détergent.
Peut-on utiliser la DLS pour tester la stabilité ou trouver un meilleur tampon ?
Une rampe en température fait partie des usages standards. Suivre la taille et le taux de comptage de 20 à 80 °C donne la température de début d'agrégation, et comparer cette valeur entre tampons, pH et additifs permet de classer rapidement des formulations avec quelques milligrammes de protéine.
La même rampe distingue deux modes de défaillance souvent confondus : une protéine qui se déplie puis agrège, et une protéine qui reste repliée mais agrège de façon colloïdale à forte concentration. Associer une rampe DLS et une courbe de fusion nanoDSF sur les mêmes conditions sépare la stabilité conformationnelle de la stabilité colloïdale, et les deux n'évoluent pas toujours dans le même sens.
Les mesures isothermes sur plusieurs heures conviennent aussi à l'agrégation lente : un échantillon maintenu à 37 °C et mesuré toutes les dix minutes donne une courbe de croissance.
Que peut-on mesurer en dehors des protéines ?
Liposomes, nanodisques, vésicules extracellulaires, pseudo-particules virales, nanoparticules polymères et inorganiques, micelles, acides nucléiques et leurs complexes. La gamme utile va d'environ 0,3 nm à quelques micromètres, la limite haute étant fixée par la sédimentation des particules hors du faisceau pendant la mesure.
Le potentiel zêta est disponible sur le même appareil pour les échantillons colloïdaux. Il demande plus de matière — environ 750 µl en cuve capillaire repliée — et une faible force ionique, un tampon physiologique écrantant la charge de surface et chauffant sous le champ appliqué. Les mesures se font donc en général entre 1 et 10 mM de sel.
Les protéines membranaires en détergent sont mesurables, à condition de tenir compte du signal des micelles ; un témoin de micelles vides apparié vaut la peine d'être envoyé.
Combien de temps cela prend-il, et récupère-t-on l'échantillon ?
Une mesure comprend trois acquisitions de dix à quinze secondes, soit moins d'une minute d'acquisition ; avec l'équilibration en température et la manipulation des cuves, quelques minutes par échantillon. Une rampe de 20 à 80 °C par pas de 2 °C prend une à deux heures.
L'échantillon n'est pas altéré par la mesure et peut être récupéré, à ce qui reste dans la cuve près. S'il est précieux, signalez-le : nous utiliserons la cuve quartz faible volume et vous le rendrons.
Comme la mesure est rapide et peu coûteuse en matière, il est utile de faire une DLS en premier contrôle sur tout échantillon destiné à une expérience plus longue, et nous le faisons souvent d'office avant une ITC ou une SPR.
Puis-je faire les mesures moi-même ?
La DLS est l'appareil le plus simple à piloter de tous ceux évoqués ici, et le plus facile à mal interpréter. Une à deux séances suffisent pour la manipulation des cuves, les procédures et les réglages d'acquisition.
Ce qui demande plus de temps, c'est de savoir quand se méfier d'un résultat : fluctuations de nombre dues à trop peu de particules, corrélogramme qui ne redescend pas à la ligne de base, pic d'intensité à 1000 nm correspondant à une poussière et non à une population, second pic annoncé à 45% parce que la conversion en volume a utilisé le mauvais indice de réfraction. Nous passons en revue ces cas sur des données réelles plutôt que dans l'abstrait.
L'envoi d'échantillons en prestation fonctionne tout aussi bien, et le rapport inclut les corrélogrammes pour que vous puissiez juger vous-même si l'ajustement mérite créance.
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