Differential Scanning Fluorimetry

Dix microlitres par capillaire sur le Prometheus, autant sur le Tycho. La concentration de travail habituelle est de 0,2 à 5 mg/ml, même si l'appareil lit la fluorescence intrinsèque sur une gamme dynamique très large et que des échantillons de quelques µg/ml à bien plus de 100 mg/ml ont été mesurés.

Pour une protéine de 30 kDa à 1 mg/ml, cela fait 10 µg par condition. Un criblage de 48 tampons coûte donc environ un demi-milligramme, ce qui explique que cette méthode ait largement remplacé la DSC pour le criblage.

Envoyez 20 à 30% de plus que le calcul ne l'indique : les capillaires se remplissent par capillarité à partir d'une petite goutte, et le volume mort du tube n'est pas négligeable à cette échelle.

Cela aide beaucoup. La mesure suit le rapport de fluorescence intrinsèque à 350 et 330 nm, qui se décale à mesure que les résidus aromatiques enfouis sont exposés au solvant. Le tryptophane domine ce signal ; la tyrosine y contribue avec une amplitude plus faible, si bien qu'une protéine à tyrosines sans tryptophane donne en général encore une courbe, plus bruitée.

Une protéine dépourvue de tout résidu aromatique ne peut pas être mesurée par fluorescence intrinsèque. Restent alors le canal de rétrodiffusion, qui détecte l'agrégation par diffusion de lumière sans aucun fluorophore et donne souvent à lui seul une transition exploitable, ou la DSF classique au SYPRO Orange en appareil de qPCR.

La position des tryptophanes compte autant que leur nombre. Un Trp unique en surface peut à peine changer d'environnement au dépliement, alors qu'un Trp enfoui dans un petit domaine donne une transition de manuel.

La température de fusion Tm à partir du point d'inflexion du rapport 350/330, et, lorsque plusieurs domaines se déplient séparément, un Tm par transition. La température d'apparition Ti, où le rapport quitte la ligne de base, est rapportée avec elle et constitue souvent la valeur la plus pertinente en formulation, puisqu'elle marque le début de la perte de structure et non le point où la moitié a disparu.

Le canal de rétrodiffusion donne indépendamment la température de début d'agrégation Tagg, sur le même capillaire et au même moment.

La reproductibilité du Tm est de 0,1 à 0,3 °C entre capillaires répliqués, ce qui rend crédibles de faibles valeurs de ΔTm dues à la liaison d'un ligand ou à un changement de tampon. Les valeurs absolues de Tm dépendent de la vitesse de balayage et se comparent au sein d'une même série plutôt qu'à une valeur de la littérature obtenue ailleurs.

Presque tout. La détection sans marquage est ce qui rend la nanoDSF tolérante là où la DSF à colorant ne l'est pas : détergents au-dessus de leur CMC, sel élevé, jusqu'à 6 M de guanidinium ou 8 M d'urée, DMSO à plusieurs pour cent, glycérol, réducteurs, nucléotides et métaux passent tous.

Cette tolérance est la principale raison pratique de la préférer au décalage thermique au SYPRO Orange. Le SYPRO se lie aux surfaces hydrophobes : les micelles de détergent le concurrencent et les protéines membranaires ne donnent en général aucun signal.

Deux choses gênent malgré tout. Les composés qui fluorescent ou absorbent fortement vers 330-350 nm faussent le rapport : un ligand très coloré ou aromatique à forte concentration exige un témoin sans protéine dans la même série de capillaires. Et tout ce qui fait précipiter la protéine avant le début du balayage donne une courbe sans transition, uniquement de la diffusion.

Pour en trouver un, oui. Un ligand qui se lie à l'état replié le stabilise et augmente le Tm, et un ΔTm de 1 à 2 °C au-dessus du bruit des réplicats constitue un vrai signal. Le criblage de fragments et la confirmation de ligands comptent parmi les usages les plus fréquents.

Pour mesurer une affinité, non, pas directement. Le ΔTm dépend de l'affinité à la température de fusion, de l'enthalpie de dépliement et de la concentration en ligand, et la relation n'est commode dans aucun sens. Un ligand nanomolaire et un ligand micromolaire peuvent produire des décalages voisins, et un ligand réel se liant également aux états replié et déplié ne produit aucun décalage. Traitez le décalage comme un oui/non assorti d'un classement grossier, et passez à l'ITC ou à la SPR pour une valeur.

La dénaturation chimique isotherme sur le même appareil donne bien un ΔG de dépliement, et y titrer un ligand est une voie vers une affinité thermodynamique, au prix d'une mesure beaucoup plus longue.

Généralement l'une de trois choses. La protéine possède deux domaines qui se déplient à des températures différentes, ce qui est une information structurale réelle. La préparation contient deux espèces — forme tronquée, population partiellement mal repliée, mélange d'états d'oligomérisation. Ou bien un cofacteur lié se dissocie à une température inférieure au dépliement de la protéine apo, produisant une petite transition précoce que l'on surinterprète facilement.

Comparer la courbe du rapport de fluorescence et la courbe de diffusion aide. Une transition visible dans le rapport mais pas en diffusion correspond à un dépliement sans agrégation immédiate ; une transition visible seulement en diffusion correspond à l'agrégation de matériel déjà déplié.

Mesurer le même échantillon à deux concentrations sépare les processus dépendant de la concentration, comme la dissociation d'un oligomère, du dépliement qui n'en dépend pas.

La stabilité thermique, ou conformationnelle, mesure à quelle température la protéine se déplie — c'est le Tm. La stabilité colloïdale mesure la facilité avec laquelle les molécules s'associent entre elles, repliées ou non, et se traduit par la température d'agrégation Tagg ou par une croissance de la diffusion à température constante.

Les deux divergent plus souvent qu'on ne le croit. Un changement de tampon peut augmenter le Tm de 4 °C et abaisser simultanément le Tagg, parce que les conditions ioniques qui stabilisent le repliement réduisent aussi la répulsion électrostatique qui maintient les molécules à distance. Pour choisir un tampon de conservation, celui qui garde la protéine en solution six mois à 4 °C n'est pas toujours celui de Tm le plus élevé.

Mesurer les deux canaux sur le même capillaire est justement ce qui rend la technique utile en formulation, et pas seulement pour relever des points de fusion.

Quarante-huit capillaires en parallèle sur le Prometheus, vingt-quatre en format réduit. Une rampe de 20 à 95 °C à 1 °C/min prend environ 75 minutes pour l'ensemble ; à 4 °C/min elle tombe à vingt minutes, au prix de la résolution entre transitions proches.

Le Tycho est encore plus rapide — une rampe fixe de 35 à 95 °C en trois minutes sur un échantillon — et convient à un contrôle rapide d'identité et de repliement sur une fraction de purification plutôt qu'à une comparaison soignée.

Un criblage de 96 conditions représente donc deux séries et une demi-journée, préparation comprise. Le temps est consommé par le pipetage des conditions, pas par le balayage.

Pour une seule courbe de fusion : 50 µl de protéine à 0,5-2 mg/ml et son tampon. Pour un criblage : un stock concentré et la liste des conditions souhaitées, ou les conditions elles-mêmes si elles ne sont pas standards. Travailler à 2-4 fois la concentration finale permet de diluer dans chaque condition plutôt que de dialyser 48 fois.

Indiquez la concentration, la masse moléculaire, le nombre de tryptophanes et de tyrosines, la présence éventuelle d'un ligand ou d'un cofacteur, et si la protéine a déjà été congelée. Si la question porte sur une comparaison précise — deux constructions, deux lots, apo contre holo — précisez laquelle, car cela détermine la disposition des capillaires et les réplicats à privilégier.

Centrifugez les échantillons avant chargement ; un précipité visible dans un capillaire donne une trace de diffusion et aucune courbe de fusion.

Oui, et c'est celle que les utilisateurs finissent le plus souvent par mener seuls. Le remplissage des capillaires demande un peu de pratique, et tout le reste se passe dans le logiciel.

Deux séances suffisent en général : une pour charger et lancer, une pour parcourir l'analyse et les modes d'échec — un rapport qui monte déjà au départ, une transition tronquée en haut de rampe, des réplicats qui s'écartent de plus d'un demi-degré. Ensuite, réserver du temps machine directement est l'arrangement habituel pour les équipes qui crible régulièrement constructions ou tampons.

Les utilisateurs occasionnels ont intérêt à envoyer leurs échantillons, en particulier pour une première expérience où le choix des conditions pèse plus lourd que le pipetage.

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