Lyophilisation

Les tampons volatils partent avec l'eau et laissent la protéine ou le peptide : bicarbonate d'ammonium, acétate d'ammonium, acide acétique dilué, acide formique, eau pure. Ce sont les cas propres, et ceux qu'utilisent la chimie des peptides et des oligonucléotides.

Tout ce qui n'est pas volatil reste dans le gâteau. Lyophiliser 1 ml de PBS laisse environ 9 mg de sels ; si vous reprenez ensuite dans 200 µl, vous obtenez un tampon cinq fois concentré. C'est acceptable si c'est prévu, gênant sinon.

Le phosphate de sodium est celui qu'il faut écarter. À la congélation, le phosphate disodique cristallise préférentiellement et le pH du liquide restant chute de deux à trois unités, jusque vers pH 4, avant même que l'échantillon soit sec. Beaucoup de protéines n'y survivent pas. Le phosphate de potassium évolue en sens inverse et bien moins fortement. L'histidine, le citrate et le Tris pardonnent davantage, même si le pKa du Tris varie beaucoup avec la température et si certains tampons aminés subliment partiellement.

Si le tampon n'est pas compatible, la solution est un dessalage vers un tampon volatil avant séchage, que nous pouvons intégrer à la même commande.

Les peptides et les petites protéines stables passent en général sans dommage. Les protéines plus grosses, les assemblages multi-sous-unités et tout ce qui dépend d'une couche d'hydratation spécifique, souvent non, et les dégâts surviennent en deux endroits distincts : à la congélation, où la formation de glace concentre tout ce qui reste en phase liquide, et au séchage, où l'eau liée à la surface de la protéine est retirée.

Un lyoprotecteur traite le second point. Le saccharose ou le tréhalose à 1-10% (m/v) remplace l'eau de surface par ses propres liaisons hydrogène et maintient la protéine dans un verre amorphe. En règle générale, le sucre doit au moins égaler la protéine en masse, et un excès de plusieurs fois est plus courant. Le mannitol est un agent de charge qui donne un gâteau solide mais cristallise : il ne protège pas à lui seul et s'emploie avec du saccharose plutôt qu'à sa place. Un tensioactif non ionique à 0,01-0,05% limite l'agrégation à l'interface glace-eau.

Pour une protéine jamais lyophilisée, sécher une petite aliquote d'essai et vérifier l'activité et l'agrégation après reprise coûte une journée et sauve le lot.

De quelques centaines de microlitres en tube Eppendorf à plusieurs centaines de millilitres en ballon. La hauteur de remplissage compte plus que le volume total : sous un à deux centimètres, car le front de sublimation doit remonter à travers la couche déjà sèche et le temps de séchage croît fortement avec l'épaisseur.

Les contenants larges et peu profonds sèchent plus vite que les récipients hauts et étroits. Pour un ballon, la congélation en couche mince — rotation du ballon dans un bain froid pour que le liquide gèle en pellicule sur la paroi — transforme une géométrie impossible en géométrie favorable.

Les tubes doivent rester ouverts, avec un bouchon percé ou une membrane, jamais fermés. Et ils ne doivent pas être remplis à ras bord : lorsque la pression chute, un échantillon incomplètement congelé peut mousser et déborder.

Une nuit pour un petit échantillon aqueux en couche mince ; deux à quatre jours pour un gros volume, un remplissage épais ou une formulation riche en sucre.

Trois étapes fixent la durée. La congélation, rapide, mais dont la vitesse détermine la taille des cristaux de glace et donc tout ce qui suit. Le séchage primaire, où la glace sublime : c'est la phase longue, et elle doit se dérouler à une température inférieure à la température d'effondrement de la solution congelée, soit environ -32 °C pour une formulation au saccharose et -30 °C au tréhalose. Le séchage secondaire, où l'eau encore liée au solide est désorbée à température plus élevée, généralement quelques heures, avec une humidité résiduelle visée de 1 à 3% ou moins.

Vouloir raccourcir le séchage primaire en montant la température est précisément ce qui produit les gâteaux effondrés : le programme dépend donc de la formulation, pas de la file d'attente.

Ajoutez le volume d'eau ou de tampon souhaité, laissez reposer quelques minutes sans agiter, puis homogénéisez doucement. Passer une solution de protéine au vortex crée de la mousse et une interface air-eau, précisément là où les protéines reconstituées agrègent.

Reprendre dans le volume d'eau initial régénère la solution de départ, sels compris, si le tampon n'était pas volatil. Reprendre dans un volume plus petit concentre tout : c'est une façon légitime de concentrer une protéine, mais elle modifie le tampon en même temps.

Les peptides séchés depuis des tampons volatils résistent parfois à l'eau et demandent un peu de DMSO, ou de l'acide acétique dilué pour les peptides basiques et de l'ammoniaque ou du bicarbonate dilué pour les peptides acides, avant dilution dans le tampon de travail.

Contrôlez ce que vous récupérez : une A280 rapide et une mesure de DLS après reprise disent si le matériel a survécu, en un quart d'heure.

Fermé et au sec. Un gâteau lyophilisé réabsorbe l'humidité de l'air en quelques minutes après ouverture du tube, et c'est l'humidité qui gouverne l'essentiel de la dégradation lente à l'état solide. Refermez sous vide ou sous azote, scellez au parafilm, ajoutez un dessiccant pour une conservation longue.

Les peptides et petites protéines stables se gardent plusieurs mois à 4 °C et plus longtemps à -20 °C. Tout ce qui est fragile doit néanmoins aller à -20 ou -80 °C. Laissez le tube revenir à température ambiante avant ouverture, faute de quoi de la condensation se forme sur la poudre froide.

L'expédition est l'avantage pratique : un échantillon sec voyage à température ambiante sans carboglace, ce qui change les possibilités pour un envoi international. Que ce soit une bonne idée pour votre protéine dépend d'abord de sa survie au séchage — c'est le test à faire avant de s'engager sur l'envoi.

L'effondrement est l'échec classique. Si la température du produit dépasse la température d'effondrement pendant le séchage primaire, la matrice amorphe s'amollit et la structure s'affaisse en un résidu vitreux collant au lieu d'un gâteau léger. Il se redissout mal, retient plus d'eau et protège moins la protéine.

La perte d'activité sans signe visible est l'autre écueil, et c'est pourquoi un contrôle d'activité ou d'agrégation après reprise fait partie du plan et non des réflexions d'après-coup.

Problèmes plus mineurs : un échantillon incomplètement congelé bout et mousse à la mise sous vide, et peut finir au plafond de la chambre ; un tube trop rempli perd du matériel de la même façon ; un gâteau séché trop brutalement en surface forme une peau et emprisonne l'humidité en dessous ; les protéines sensibles à l'oxydation se dégradent en quelques mois à l'état sec si le tube est scellé sous air.

Dites-nous ce que vaut l'échantillon. Une préparation irremplaçable est séchée prudemment, avec un séchage primaire long, et cette décision se prend avant la course, pas après.

Souvent non, et la question mérite d'être posée avant d'engager l'échantillon.

Pour conserver une solution protéique, congeler rapidement de petites aliquotes dans l'azote liquide et les garder à -80 °C est plus doux, plus rapide et réversible. La lyophilisation prend tout son sens quand il faut expédier à température ambiante, éliminer complètement un tampon ou un solvant volatil, disposer d'une masse sèche définie pour l'application finale, ou laisser le matériel à température ambiante longtemps.

Pour éliminer le solvant d'un petit échantillon peptidique, un concentrateur sous vide est plus rapide et suffisant, même s'il chauffe l'échantillon et n'offre aucune protection à ce qui est fragile.

Si l'objectif est simplement de concentrer une protéine diluée, l'ultrafiltration centrifuge est en général le meilleur outil, puisque le séchage concentre les sels en même temps que la protéine.

Peptides et oligonucléotides de synthèse, protéines purifiées et complexes protéiques, composants de tampons et de milieux, sucres et polysaccharides, et essais de formulation où plusieurs compositions d'excipients sont séchées côte à côte puis comparées.

Les échantillons contenant du détergent sont difficiles. La plupart des détergents ne sèchent pas en solide et laissent un résidu huileux qui ne se redissout jamais complètement, et une protéine séchée depuis un détergent revient rarement dans un état micellaire défini.

Les échantillons contenant du glycérol ne peuvent pas être lyophilisés : le glycérol ne sublime pas et ne gèle pas en solide aux températures en jeu, on obtient un sirop. Le glycérol doit être retiré par dessalage au préalable.

Les cellules vivantes et le matériel viable sortent de notre cadre ; cela demande un protocole validé avec des cryoprotecteurs spécifiques et relève d'un autre métier.

L'échantillon, sa composition — tampon, sel, glycérol, détergent ou sucre déjà présents —, le volume total, et l'usage prévu du matériel séché.

Ce dernier point modifie le protocole plus que tout le reste. Sécher pour une conservation longue, sécher pour éliminer un tampon volatil avant une analyse par spectrométrie de masse, et sécher pour obtenir une masse définie à peser sont trois travaux différents avec trois points d'arrivée différents.

Précisez si l'échantillon supporte une congélation à -80 °C ou s'il demande une congélation plus lente, s'il existe un test d'activité pour le contrôler ensuite, et si vous souhaitez que nous ajoutions un lyoprotecteur ou que nous séchions tel quel. Si le matériel est irremplaçable, envoyez d'abord une petite aliquote d'essai — c'est le conseil qui évite le plus de pertes.

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