Fast protein liquid chromatography

Exclusion stérique, échange d'ions, affinité, interaction hydrophobe et dessalage, sur systèmes ÄKTA Pure et ÄKTA Start.

En filtration sur gel, les colonnes de routine sont les Superdex 75 et Superdex 200 Increase 10/300 GL (lit de 24 ml, de l'analytique au semi-préparatif) et les HiLoad 16/600 (lit de 120 ml, préparatif). L'échange d'ions se fait sur HiTrap Q et SP en formats 1 et 5 ml, l'affinité sur HiTrap IMAC, GST et Strep, et l'échange de tampon sur HiTrap Desalting.

Le choix dépend de l'objectif : une étape de polissage avec contrôle des agrégats n'a rien à voir avec une purification en trois étapes à partir d'un lysat. Décrire l'objectif dans la commande compte davantage que nommer une colonne, celle-ci découlant de celui-là.

Sur une colonne SEC, la limite porte sur le volume avant de porter sur la masse. Sur une Superdex 200 Increase 10/300 GL et son lit de 24 ml, 250 à 500 µl donnent une bonne résolution, et environ 1,2 ml (5% du volume de colonne) constitue le plafond absolu, avec des pics visiblement élargis. Une HiLoad 16/600 accepte 1 à 5 ml sur son lit de 120 ml.

La masse est limitée par la viscosité plutôt que par la capacité : au-delà d'environ 10-20 mg/ml de protéine totale, la bande d'échantillon devient assez dense pour percer le lit en doigts et déformer les pics. Vingt milligrammes dans 500 µl passent sans problème pour une protéine ordinaire ; la même masse dans 100 µl, non.

L'échange d'ions et l'affinité sont le cas inverse : c'est la masse qui compte. Les colonnes HiTrap fixent de l'ordre de quelques dizaines de milligrammes de protéine par millilitre de résine, et le volume d'échantillon est presque illimité puisque la protéine se concentre sur la colonne.

Centrifugez, puis filtrez à 0,22 µm. Une particule qui passerait inaperçue dans un tube Eppendorf bouche le fritté en tête de colonne, et déboucher une Superdex coûte plus cher que la course elle-même. Si la protéine ne supporte pas la filtration, la solution de repli est 15 minutes à 20 000 g et un prélèvement soigneux au-dessus du culot.

L'échantillon doit être dans un tampon compatible avec la première étape. En SEC, cela laisse presque tout ouvert, à condition d'éviter les interactions avec la matrice : une force ionique trop faible favorise les interactions ioniques avec la Superdex, d'où 100-150 mM de NaCl comme référence habituelle. En échange d'ions, la conductivité de l'échantillon doit être inférieure au seuil de fixation de la protéine, ce qui impose souvent une dilution ou un dessalage préalable. Les tampons que nous préparons sont filtrés et dégazés ; si vous apportez les vôtres, filtrez-les à 0,22 µm.

Ce que nous ne prenons pas : du matériel pathogène non inactivé ou tout ce qui dépasse le niveau de confinement 1 sans accord préalable, les échantillons contenant une forte proportion de solvants organiques, et tout ce qui laisserait la colonne contaminée pour l'utilisateur suivant. Précisez la nature de l'échantillon au moment de la commande, pas à sa réception.

Une masse apparente, obtenue par étalonnage avec des protéines standards, et à lire avec prudence.

La SEC sépare selon le rayon hydrodynamique et non selon la masse. Une protéine globulaire se comporte comme les standards globulaires et l'estimation est raisonnable. Une protéine allongée, désordonnée ou fortement glycosylée migre comme un objet bien plus gros : une protéine intrinsèquement désordonnée de 20 kDa peut éluer là où élue un standard globulaire de 60 kDa, ce qui alimente régulièrement des conclusions erronées sur l'état d'oligomérisation dans la littérature.

Une interaction faible avec la matrice joue en sens inverse, retarde l'élution et fait paraître la protéine plus petite.

Si la masse est vraiment la question, la SEC-MALS la donne indépendamment de la forme, et l'AUC la donne avec le rapport de friction. Le volume d'élution SEC s'utilise au mieux comme comparaison entre échantillons apparentés passés sur la même colonne, pas comme une mesure absolue.

Parfois, dans des limites qu'il vaut mieux connaître avant de payer une nouvelle course.

Sur une seule colonne SEC, deux espèces doivent différer d'environ un facteur deux en masse — plus exactement, présenter une différence nette de rayon hydrodynamique — pour être résolues. Un monomère et un dimère se séparent ; une protéine et la même protéine amputée de vingt résidus, non. Passer d'une Increase de 24 ml à une HiLoad de 120 ml, diviser le débit par deux et réduire le volume injecté aident, et l'ensemble peut transformer un épaulement en deux pics. Rien de tout cela ne séparera des espèces qui diffèrent de 10% en taille.

Là où la SEC s'arrête, la réponse est généralement un autre mode plutôt qu'une meilleure SEC. L'échange d'ions sépare sur la charge et résout une forme désamidée ou tronquée invisible en SEC ; l'interaction hydrophobe révèle des différences conformationnelles. Enchaîner deux modes orthogonaux résout la plupart des cas qui méritent de l'être.

Oui, et c'est une commande courante : capture IMAC, puis dessalage ou SEC en polissage, avec SDS-PAGE sur les fractions.

Envoyez le lysat clarifié, pas le culot cellulaire, sauf si la lyse a été prévue dans la prestation. Le lysat doit être centrifugé vigoureusement et filtré : charger un extrait brut non filtré sur une colonne IMAC est le moyen le plus rapide de la détruire. Prévoyez 10 à 20 mM d'imidazole dans le tampon de charge pour limiter la fixation non spécifique, et indiquez si la construction porte un site de protéase et si vous souhaitez que l'étiquette soit coupée.

Deux points à vérifier de votre côté au préalable : que l'étiquette est accessible dans la protéine repliée, et que le lysat ne contient pas de chélateur. L'EDTA d'un tampon de lyse arrache le nickel de la colonne, et cela arrive plus souvent qu'on ne l'imagine.

L'ÄKTA Start est un système compact doté d'un détecteur UV à longueur d'onde fixe (280 nm), d'un conductimètre, d'une pompe à échantillon et d'un collecteur de fractions. Débit jusqu'à environ 5 ml/min et limite de pression basse, de l'ordre de 0,5 MPa. Il assure très bien la capture par affinité, le dessalage et les gradients par paliers sur colonnes HiTrap ; sa limite est qu'il ne peut pas alimenter une colonne analytique à contre-pression élevée.

L'ÄKTA Pure travaille du microlitre à quelques dizaines de millilitres par minute jusqu'à 20 MPa, lit plusieurs longueurs d'onde UV simultanément, gère des gradients fins, la commutation de colonnes, l'injection par boucle ou par pompe, le suivi du pH et la régulation de température. Tout ce qui met en jeu une colonne Superdex Increase, un gradient d'échange d'ions peu pentu, une méthode à plusieurs étapes ou un suivi A260/A280 y passe.

En pratique : capture et dessalage de routine sur le Start, analytique et multi-étapes sur le Pure. Le choix découle de la méthode et ne change rien à ce que vous recevez.

Une Superdex 200 Increase 10/300 à 0,5-0,75 ml/min demande 40 à 60 minutes pour un peu plus d'un volume de colonne. Une HiLoad 16/600 à 1 ml/min tourne plutôt autour de deux heures et demie. Une capture par affinité avec élution par palier sur une HiTrap de 5 ml prend 20 à 30 minutes, un dessalage moins de dix.

L'équilibration est l'étape qu'on oublie : une colonne SEC réclame un à deux volumes de colonne de tampon avant la première injection, donc la première course de la journée commence une heure avant le premier échantillon.

Une journée réaliste, c'est six à huit SEC analytiques, ou deux à trois HiLoad préparatives, ou une séquence complète capture-plus-polissage sur un échantillon. Le délai de rendu dépend de la file d'attente et de la nécessité éventuelle de mettre au point une méthode.

En fractions, dans le tampon d'élution, et plus diluée qu'à l'entrée. La SEC dilue typiquement d'un facteur deux à quatre ; une élution d'affinité concentre au contraire, mais restitue la protéine dans le tampon d'élution — imidazole, glutathion, pH acide.

Vous recevez le chromatogramme sous forme de fichier de données avec l'UV, la conductivité et les repères de fractions, la numérotation des fractions, et une SDS-PAGE des fractions pertinentes si elle faisait partie de la commande. Le regroupement suit votre consigne : pureté au détriment du rendement, ou l'inverse. Précisez votre préférence, les deux choix donnant des résultats visiblement différents.

La concentration par ultrafiltration centrifuge et l'échange de tampon peuvent s'ajouter, mais coûtent tous deux de la matière — la concentration est l'étape où les protéines fragiles agrègent, et il vaut la peine de se demander si 10 mg/ml sont vraiment nécessaires ou si 2 mg/ml suffiraient.

Pour les personnes de laboratoires partenaires qui purifient régulièrement, oui. La formation couvre le système, le logiciel, l'entretien des colonnes et les limites de pression qui protègent celles-ci d'une erreur coûteuse.

Les utilisateurs formés réservent eux-mêmes leur temps et lancent leurs propres méthodes, avec les colonnes de la plateforme ou avec une colonne qui leur est propre et reste dédiée à leur échantillon. Une colonne dédiée est l'option raisonnable pour tout ce qui risque de laisser des résidus : acides nucléiques, protéines membranaires collantes, échantillons ayant des antécédents d'agrégation.

L'envoi en prestation est l'alternative et ne demande aucune formation. Les purifications à partir de lysat, la mise au point de méthodes et tout ce qui exige une colonne préparative se font de toute façon le plus souvent ainsi.

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